能夠想到四個重要因素影響背景是亮還是暗(我的經驗來自生物學的組織/細胞免疫熒光染色實驗):
1. 光圈。光圈開得大,顧名思義所有光信號包括背景信號都會增強。
2. 曝光時間。光信號再強,你只選取其中很少一部分來成像,也能夠控制圖像中的信號強度。
3. 樣品/玻片本身的自發熒光。
4. 樣品的非特異性染色。
總體是一個所有檢測手段中共通的問題,即信噪比,信號與噪聲比率。
1,2對信噪比影響不大,在背景過強時很難通過調整1,2來解決問題。如果背景不存在過強問題,則通過1確保有用信號足夠強,通過2減低曝光時間至背景充分黑暗即可。
3,4才是控制信噪比的關鍵因素。自發熒光無法完全避免,只能通過選取自發熒光較低的材料來控制,另外固定及染色過程中的一些試劑有可能影響樣本的自發熒光。非特異性染色是更為常見的造成背景問題的原因,通過優化封閉條件,抗體/試劑用量,染色時長與溫度等條件來調整。